MESA 4: REALIZAR UNA BIOMETRIA HEMATICA: TINCIONES SANGUINEAS

TINCIONES SANGUINEAS

Descripción de los tipos de tinciones

Para lograr saber que son las tinciones sanguíneas tenemos que tener en cuenta saber que es un frotis.

§ Frotis sanguíneos

El objetivo de realizar una extensión de sangre periférica o frotis sanguíneo es obtener una delgada capa de sangre sobre un portaobjetos, que luego teñiremos con una coloración especifica con el fin de poder evaluar la proporción de cada leucocito (formula leucocitaria relativa) y la morfología de las células sanguíneas (leucocitos eritrocitos y plaquetas).

Los frotis sanguíneos deben realizarse inmediatamente cuando se utiliza sangre fresca, o dentro de las 2-3 horas de la extracción si se añade anticoagulante (preferiblemente EDTA, ya que no produce deformación de las células).

ü Observación microscópica

En hematología, el frotis sanguíneo es el test más simple y de más valor diagnostico, pero hay que realizar siempre un diagnostico sistemático y ordenado.

Primeramente se observa a bajos aumentos (10x, 40x), para un estudio global de frotis, apreciar su calidad y localizar la zona en la que el frotis es más adecuado para su lectura. Un frotis correcto será más grueso cerca de la gota de sangre y la capa de sangre se ira afinando hacia el final del portaobjetos. Los lugares más aptos o áreas de lectura son aquellos en los que la extensión de la células se ha conseguido en una sola capa, los eritrocitos se tocan entre si pero no están sobrepuestos, están bien teñidos y no se han producido precipitados de los colorantes. Cuando se observe una zona apta , pasar a aumento de 100x, utilizando una pequeña gota de aceite de inmersión directamente sobre el frotis de la zona a observar.

« TIPOS DE TINCIONES.

Las tinciones hematológicas pueden clasificarse según distintos criterios:

· Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales.

· Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el diagnóstico hematológico, se dividen en tinciones tradicionales y especiales.

§ Tinciones vitales y no vitales.

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas.

Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno.

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijación puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol.

§ Tinciones tradicionales y especiales.

Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que con frecuencia derivan de la anilina (tinciones tradicionales o clásicas). Estos colorantes se reúnen en 4 grupos:

· Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.

· Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno.

· Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno.

· Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante. Uno de ellos es el Sudán III empleado para teñir las grasas.

También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él preparó.

Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante ácido (eosina) y de colorantes básicos (tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilación oxidatiya (colorantes tipo azur). Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que más frecuentemente se emplean en el diagnóstico hematológico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinación con la de May-Grünwald).

También hay tinciones panópticas rápidas que producen una coloración fácil y rápida de las estructuras celulares. Las tinciones especiales sólo se usan en circunstancias específicas. Son de dos clases:

· Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiación visible, de un color característico. Los fluorocromos más utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro.

· Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, más o menos abundante, o la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos.

Sirven para reconocer células leucocitarias (normales o anómalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas células leucocitarias inmaduras a la línea granulocítica o a la monocítica.

§ Tinción de Giemsa

Estos organismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.

La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las ricketsias localizadas dentro de la célula huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el plasmodium falciparum. Este método de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma). Los cromosomas pueden ser tratados con varios compuestos químicos que producen la alternancia de bandas claras y oscuras a lo largo de los cromosomas. Cada cromosoma tiene un patrón de bandas característico, permitiendo que aberraciones estructurales como borrados, duplicaciones o sutiles translocaciones sean detectadas, al igual que permite la identificación de cromosomas marcadores.

§ Tinción de Wright

La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky. Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y.

Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico. La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

La tinción de Wright es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades. Lleva el nombre de James Homer Wright, su descubridor, que la obtuvo modificando la tinción de Romanowsky, en 1902.

Debido a que ayuda a distinguir fácilmente las células de la sangre se convirtió en una técnica muy usada para el conteo de los glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones.

§ Tinción panóptico rápido.

Este método de tinción diferencial es un sistema que aúna la policromía y la calidad que proporcionan los métodos clásicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecución (15 segundos solamente).

Frente a las técnicas de tinción descritas anteriormente, donde el colorante se extendía sobre el frotis, ésta presenta la peculiaridad de ser un método de inmersión, donde el frotis se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado.

Depositamos una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100 x.

Las coloraciones obtenidas en las células sanguíneas son similares a las de la tinción de Wright y Giemsa. Sin embargo, podemos variar la intensidad de la tinción modificando el número de inmersiones en los colorantes nº 2 y nº 3, según se desee destacar las tonalidades rosas o las azules.

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